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真固生物SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术|真固生物出席2018第五届NGS创新开发者大会

日期:2018-04-03 11:30:03分享到

2018331-41日,真固生物应邀参加在南京瑞斯丽酒店举办的“2018第五届NGS创新开发者大会”。在大会上,真固生物研发总监肖建锋博士盛情分享真固生物独有的基于多重PCR靶向NGS文库制备技术——茎环阻遏介导的扩增方法( Stem-Loop Inhibition Mediated amplification,SLIMamp)。

1.肖建峰博士在大会分享“SLIMamp——基于多重PCR的靶向文库制备技术”

肖博士认为“通过多重PCR靶向构建NGS文库需要解决目标区域重叠区域和引物二聚体对于目标区域的影响”,并针对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本 (Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE) 制备文库提出解决方案。

多重PCR对于重叠区域的处理

对于较长目标区域,例如BRCA1/2基因全外显子测序,在进行多重PCR靶向文库制备时为了完全覆盖目标区域,相邻的目标区域必须部分重叠。由于重叠区域的短扩增子扩增效率较高,会极大抑制目标区域的扩增,影响目标区域产物。因此通常解决这个问题是采用将文库分成不同Pool进行,避免重叠区域的影响,但这样会造成整个反应体系复杂,实验操作繁琐,而且对于样本的消耗较大,特别是对于活检和血液样本,直接影响其检测灵敏度。因此真固生物尝试在一管体系中完成NGS文库制备。

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2.重叠区域的影响

SLIMamp技术构建文库流程比较简单,通过两步PCR和两步纯化得到目标区域的文库。其中第一步PCR是引物(含Tag)与目标区域结合,第二步PCR是连接测序接头,使得构建的文库可以用于上机测序。SLIMamp技术通过独特的引物设计,使得重叠区域扩增子形成一个茎环结构,同时提高第二步PCR过程中的退火温度,进一步抑制重叠区域扩增子的产生。真固生物通过这种技术成功研制出了针对BRCA1/2基因全外显子测序的建库试剂盒。2016年,真固生物美国母公司Pillar Biosciences应用抑制目标区域重叠区域扩增方法构建NGS文库申请了专利——“Selective Amplification of Overlapping Amplicons”(专利公开号:WO 2016/144619 A1)。

3.重叠区域扩增子选择性扩增方法

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4. 减少引物二聚体扩增的方法

FFPE样本建库处理

多重PCR靶向NGS文库构建在解决了重叠区域的一管扩增和引物二聚体的问题后,对于一般性质量较好的组织样本文库制备都可获得较高质量的文库。但是,由于FFPE样品的DNA容易发生严重的降解、损伤,所以对此类样本建库提出更高的要求。真固生物通过独特的引物设计、原材料优选、反应体系优化和临床样本验证等流程,使得在针对严重降解的FFPE样本建库都有较高的质量。

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5.FFPE样本建库一般性建议

PiVAT智能化生物信息分析

真固生物自主设计了一套智能化生物信息分析系统(PiVAT),并针对不同的Panel配套相应的分析模块,通过Web界面一步操作实现测序数据从fastq文件到突变列表的全部工作。PiVAT具有独创的生物信息学算法并持续不断更新优化,能够显著提高测序的灵敏度和特异性。在重度降解的FFPE和血浆样本中通过质量分数重新校正、局部重新比对和背景噪音的过滤提高突变检测的灵敏度和可靠性。

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6.PiVAT

2018第五届NGS创新开发者大会

2018第五届NGS创新开发者大会以“价值创造”为主题,汇聚了业内三百多位技术大咖和行业精英,共同探讨NGS的技术基础研发、未来发展以及临床应用。

7.2018第五届NGS创新开发者大会

真固生物作为NGS领域拥有两项多重PCR靶向建库专利技术的拥有者,为临床实验室提供简便、快速、高效的Panel用于指导临床治疗。20183月,真固生物与全球最大的测序平台提供商Illumina达成战略合作,进一步确立了真固生物在整个NGS市场上的作用和地位。真固生物建库平台具有较强的兼容性(个性化定制Panel)和开放性(支持IVDCRO+CMO合作模式)。本次真固生物受组委会邀请参加2018第五届NGS创新开发者大会,在5号展台与业界各位大咖和专家同道一起交流,共同努力推进NGS的发展。